SiNAPSA, nedelja, 24. januar 2021

eSiNAPSA

Spletna revija za znanstvenike, strokovnjake
in nevroznanstvene navdušence

Od človeških nevronov do možganskih organoidov – nova obzorja v nevroznanosti

Vesna M. van Midden

Eden izmed novejših pristopov v nevroznanosti je preučevanje nevronskih kultur, pridobljenih iz »odraslih« človeških celic, in nam nudi nove odgovore o delovanju in vlogi posameznih tipov možganskih celic ter njihovih medsebojnih interakcijah. Napredek v znanosti pa nam je omogočil tudi pripravo možganskih organoidov – drobnih skupkov možganskega tkiva, ki posnemajo zarodne stopnje različnih delov možganov.

V razvitem svetu bolezni možganov predstavljajo enega izmed vodilnih vzrokov za slabšo kvaliteto življenja 1. Z večanjem populacije in z njenim staranjem lahko pričakujemo, da se bo breme nevroloških bolezni zgolj povečevalo, zato je razvoj na področju razumevanja in zdravljenja nevroloških bolezni ena izmed prioritet medicine enaindvajsetega stoletja 2.

Navkljub hitremu napredku v znanosti pot v raziskovanju možganskih bolezni ni lahka, saj raziskovanje omejuje več faktorjev. Možgani so izjemno zapleten organ, ki je z vseh strani zaščiten z več plastmi možganskih ovojnic in obdan z lobanjo. Možganske celice v grobem delimo na nevronske in oporne (glialne) celice, znotraj teh dveh skupin pa obstaja več podtipov, ki se močno razlikujejo tako po morfologiji kot po njihovi vlogi v posameznih strukturah živčnega sistema 3. Razumevanje delovanja možganov je tako še vedno pomanjkljivo, velik delež možganskih bolezni ostaja nepojasnjen in posledično neozdravljiv 4.

Odvzem biopsij in spremljanje delovanja možganov in vivo je zaradi tveganja za zdravje in etičnih pomislekov močno omejeno in zelo redko upravičeno, zato je velik del izsledkov s področja nevroznanosti osnovan na živalskih modelih in nesmrtnih celičnih linijah 5. To pomeni, da delovanje živčnih celic preučujemo bodisi v laboratorijskih živalih, na celičnih linijah živalskega izvora ali pa na gojenih človeških živčnih celičnih linijah rakavega izvora. Ob tem velja poudariti, da so med živčno celico zdravega posameznika in živčno celico živalskega oz. rakavega izvora pomembne razlike v strukturi, fiziologiji in delovanju na molekularnem nivoju. Raziskave na slednjih zato pogosto ne vodijo do zaključkov, ki bi jih lahko uporabili v kliniki.

Zato je odločilnega pomena, da pri raziskovanju uporabljamo celice, ki so po strukturi in funkciji čim bolj podobne našim odraslim človeškim možganskim celicam. Še bolje pa bi bilo, če bi lahko v raziskovanju upoštevali tudi medsebojne interakcije več različnih tipov in se s tem kar najbolje približali in vivo pogojem 5.

Velik napredek predstavlja pristop, ki omogoča tvorbo človeških induciranih pluripotentnih matičnih celic iz odraslih celic (t. i. človeške inducirane pluripotentne matične celice; angl. human induced pluripotent stemm cells; hiPSC). Za razvoj postopka je leta 2012 japonski raziskovalec Shinya Yamanaka prejel Nobelovo nagrado. Večina celic v našem telesu je namreč diferenciranih, kar pomeni, da so se tekom razvoja iz zarodnih celic specializirale v določen tip celic in se v fizioloških pogojih ne morejo vrniti nazaj v zarodno obliko. Njegova raziskovalna skupina je identificirala 4 t. i. »dejavnike Yamanaka«, ki lahko v odrasli vezivni celici sprožijo dediferenciacijo nazaj v pluripotentno celico 6. To pomeni, da celica po funkciji postane podobna zarodnim celicam in ima potencial, da se pod vplivom pravilne kombinacije okoljskih faktorjev teoretično razvije v katerokoli telesno celico, med njimi tudi v nevronske in glialne celice 7. V teoriji to pomeni, da lahko iz kožne biopsije (ki je precej manj tvegana od možganske) pripravimo pluripotentne matične celice, ki jih nato lahko vzgojimo v različne živčne celice.

Postopki priprave induciranih matičnih celic se med seboj razlikujejo, vendar se vsi držijo določenih zaporednih stopenj. Po odvzemu kožnega vzorca je potrebna priprava celičnih kultur, v katerih namnožimo fibroblaste in jih izoliramo. V celice nato na različne načine uvedemo ustrezno kombinacijo rastnih faktorjev 6 7 8. Najpogosteje so to t. i. dejavniki Yamanaka (Oct34, Sox2, Klf4 c-Myc), kasneje pa sta bila identificirana še dejavnika Nanog in Lin-28. Vneseni faktorji v celici sprožijo proces dediferenciacije, ki postopoma postajajo vedno bolj podobne zarodnim celicam. Tako spremenjene celice vzgajamo v primerni hranilni raztopini, ki celicam omogoča rast in razvoj. Ko kolonije dosežejo zadovoljivo velikost, jih razporedimo v posamezne jamice, s čimer so pripravljene za nadaljnjo uporabo 6 7 8.

HiPSC lahko diferenciramo v različne somatske celice. Če se odločimo celice diferencirati v nevrone, bomo s pomočjo različnih specifičnih transkripcijskih dejavnikov inducirali tvorbo nevroepitelnih progenitornih celic. Te diferenciramo v specifične nevronske progenitorne celice (progenitorni spinalni motorični nevroni, kortikalni glutaminergični in GABA-ergični nevroni, mezencefalni dopaminergični nevroni, glialne celice, in druge), iz katerih v ustrezni hranilni raztopini nastanejo zgodnji in kasneje še zreli odrasli nevroni. Z natančnim vodenjem diferenciacije lahko vzgojimo celične kulture, ki so značilne za različne dele živčnega sistema (frontalni reženj, hrbtenjača, mezencefalon, glialne celice in druge)5 9. Po končani diferenciaciji nevroni ostanejo na razvojnem nivoju fetalnih nevronov 6 7 8.

Celične kulture, pridobljene na tak način, so izjemnega pomena v raziskovanju bolezni možganov, saj imajo – za razliko od nesmrtnih celičnih linij, ki pogosto izvirajo iz rakavih celic – normalen genotip, pripravimo pa lahko tudi kulture z genotipom našega bolnika 9. Takšne celične kulture so bolj reprezentativne in med drugim omogočajo vpogled v pacientovo lastno morfologijo, fiziologijo in presnovo na molekularni ravni 9. Posamezne nevronske kulture lahko med seboj tudi kombiniramo in tako dobimo kombinirane nevronske in glialne kulture, ki omogočajo preučevanje interakcij med posameznimi tipi celic 5.

Posebno poglavje pa predstavlja tvorba človeških možganskih organoidov. Možganski organoidi so kompleksne tridimenzionalne kombinirane nevronske kulture, ki poleg zastopanosti posameznih tipov celic posnemajo tudi strukturo različnih delov možganov (slika 1). Po tem ko pridobimo hiPSC, jih gojimo v hranilni raztopini, ki omogoča tvorbo embrioidnega telesca. S pomočjo nevralnih indukcijskih faktorjev spodbudimo tvorbo nevroektoderma in ga vzgajamo v kapljici posebnega gostega medija, ki zagotavlja prehrano in omogoča rast 10 11 12. Na tak način dobimo heterogen organoid, ki dobro posnema embrionalni razvoj možganov, le da sinapse ne dosežejo primerne zrelosti.

Slika 1
Slika 1. Možganski organoid v razvoju, pridobljen iz hiPSC, prikazan s svetlobnim mikroskopom. V enem izmed izrastkov na zgornjem robu organoida vidna naplaščenost, ki spominja na plasti možganske skorje. NIH Image Gallery from Bethesda, Maryland, USA / Public domain

Zato se je razvil še drug pristop, kjer že zgodaj v razvoju možganskega organoida s pomočjo specifičnih rastnih faktorjev aktivno usmerjamo diferenciacijo v posamezne dele možganov (čelna skorja, mezencefalon, ipd.) 12. Na tak način dosežemo manj variabilnosti in višjo stopnjo zrelosti nevronov. Kortikalni nevroni, pridobljeni na tak način, so elektrofiziološko razviti, imajo spontano aktivnost, so obdani z astrociti in tvorijo funkcionalne sinapse 13. Z združevanjem dveh ali več vrst organoidov v možganski organoidni skupek (angl. assembloid) lahko preučujemo tvorbo žil, krvno-možganske bariere in vlogo mikroglije pri razvoju in zorenju nevronov 14.

Možganski organoidi nam omogočajo raziskovanje nevrorazvojnih in nevrodegenerativnih bolezni, kot so avtizem, shizofrenija, Alzheimerjeva demenca in Parkinsonova bolezen. Z vnašanjem genskih popravkov lahko ugotavljamo vlogo posameznih genskih različic pri razvoju bolezni. Poleg tega omogočajo preskušanje učinkovitosti zdravil in vpliv infekcij na razvoj možganov. Tako so med drugim igrali izjemno vlogo pri ugotavljanju vzroka za z virusom ZIKA povzročeno mikrocefalijo 10.

Z razvojem uporabe možganskih organoidov v predkliničnem in kliničnem raziskovanju pa se odpirajo tudi novi izzivi. Zavedati se moramo, da so možgani organ, ki se v veliki meri razvije po samem rojstvu glede na dražljaje in vplive iz okolja. Nevroni, pridobljeni iz hiPSC, dosežejo razvojni nivo fetalnih nevronov, podobno velja za možganske organoide in posledično predstavljajo zgolj grob približek nevronov, ki so prisotni v možganih odrasle osebe. Bolezni možganov, ki se pojavijo v starosti, zato kljub vzpodbudnim začetnim rezultatom še vedno predstavljajo pomemben izziv.

Poleg tega je potrebno izpostaviti številna etična vprašanja, ki se pojavljajo ob uporabi človeških možganskih organoidov. Kljub temu, da trenutno ne dosegamo dovolj visoke stopnje zrelosti in/ali kompleksnosti, bi lahko teoretično v prihodnosti prestopili nedefinirano mejo, preko katere bi spontana aktivnost v možganskem organoidu lahko odražala bolečino, zavest ali pa celo misel 15 16. Zato je nujno, da jasno in odprto naslovimo vprašanja in pomisleke v zvezi z vzgojo človeških možganov v laboratoriju.

Z vsakim korakom, ki posnema in vivo razmere, kot sta uporaba kombiniranih kultur in vzgoja večjih in kompleksnejših možganskih organoidov, odpiramo in odgovarjamo na nova vprašanja in rešujemo nove izzive, hkrati pa povečujemo potrebo po interdisciplinarnem sodelovanju v znanosti 5 9.

    ___
  1. Feigin VL, Nichols E, Alam T, et al. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol. 2019;18(5):459-480. doi:10.1016/S1474-4422(18)30499-X 

  2. Carroll WM. The global burden of neurological disorders. Lancet Neurol. 2019;18(5):418-419. doi:10.1016/S1474-4422(19)30029-8 

  3. Cloutier MM, Thrall RS. Berne & Levy Physiology.; 2017. 

  4. Scadding JW, Losseff N. Clinical Neurology. Hodder Arnold; 2012. 

  5. Fernando MB, Ahfeldt T, Brennand KJ. Modeling the complex genetic architectures of brain disease. Nat Genet. Published online 2020. doi:10.1038/s41588-020-0596-3 

  6. Amabile G, Meissner A. Induced pluripotent stem cells: current progress and potential for regenerative medicine. Trends Mol Med. 2009;15(2):59-68. doi:10.1016/j.molmed.2008.12.003 

  7. Park IH, Lerou PH, Zhao R, Huo H, Daley GQ. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2008;3(7):1180-1186. doi:10.1038/nprot.2008.92 

  8. Swistowski A, Peng J, Liu Q, et al. Efficient generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells under defined conditions. Stem Cells. 2010;28(10):1893-1904. doi:10.1002/stem.499 

  9. Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, et al. CRISPR Interference-Based Platform for Multimodal Genetic Screens in Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 2019;104(2):239-255.e12. doi:10.1016/j.neuron.2019.07.014 

  10. Wang H. Modeling Neurological Diseases With Human Brain Organoids. Front Synaptic Neurosci. 2018;10. doi:10.3389/fnsyn.2018.00015 

  11. Di Lullo E, Kriegstein AR. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 2017;18(10):573-584. doi:10.1038/nrn.2017.107 

  12. Bagley JA, Reumann D, Bian S, Lévi-Strauss J, Knoblich JA. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 2017;14(7):743-751. doi:10.1038/nmeth.4304 

  13. Jeong HJ, Jimenez Z, Mukhambetiyar K, Seo M, Choi JW, Park TE. Engineering Human Brain Organoids: From Basic Research to Tissue Regeneration. Tissue Eng Regen Med. Published online April 23, 2020:1-11. doi:10.1007/s13770-020-00250-y 

  14. Pasca SP. Assembling human brain organoids. Science (80- ). 2019;363(6423):126-127. doi:10.1126/science.aau5729 

  15. Farahany NA, Greely HT, Hyman S, et al. The ethics of experimenting with human brain tissue comment. Nature. 2018;556(7702):429-432. doi:10.1038/d41586-018-04813-x 

  16. Sawai T, Sakaguchi H, Thomas E, Takahashi J, Fujita M. The Ethics of Cerebral Organoid Research: Being Conscious of Consciousness. Stem Cell Reports. 2019;13(3):440-447. doi:10.1016/j.stemcr.2019.08.003 

Vesna M. van Midden, dr. med.
Mlada raziskovalka
Klinični oddelek za bolezni živčevja
Nevrološka klinika, UKC Ljubljana