SiNAPSA, Saturday, 25. May 2024

eSiNAPSA

Spletna revija za znanstvenike, strokovnjake
in nevroznanstvene navdušence

Etično naravnana animalna nevroznanost

Maša Čater

Vedenjsko testiranje laboratorijskih glodalcev v laboratorijskem okolju se je začelo v 1890-ih s študijami Millsa, Klineja in Smalla 1 2 3. Pred temi zgodnjimi študijami so bile le opazovalne študije o vedenju divjih živali 4. Vendar pa sistematična opazovanja in kvantifikacija vedenjskih rezultatov še dolgo niso bili na voljo. Večina vedenjskih testov za proučevanje vedenja in psihologije laboratorijskih glodalcev se je razmahnila šele ob začetku 20. stoletja in vse odtlej je bil najpogosteje v uporabi sistem nagrade ali kazni (Slika 1). Z razvojem metod v znanosti in povečevanju zavedanja o dobrobiti laboratorijskih živali so se vedenjski testi začeli spreminjati in izboljševati v smeri izboljšanega počutja živali in povečani ponovljivosti rezultatov.

Slika 1
Slika 1: Najpogosteje se v vedenjskih testih v nevroznanstvenih študijah uporabljajo laboratorijske podgane in miši in sistem nagrajevanja in kaznovanja (OpenBehavior, Behavior Apparatus - OpenBehavior (american.edu), 1.7.2023)

Mills je sredi 90-ih let 19. stoletja predstavil metodo ontogenetskega dnevnika za glodavce, s katerim je preučeval fizični in psihološki razvoj 1. Kline in Small sta uvedla vedenjske teste za oceno kognicije in prav njun sodelavec, Stewart, je prvi uporabil kvantitativni test za oceno motorične aktivnosti glodalcev 5. Stewartovi poskusi so tudi navdihnili Klineja k uporabi podgan kot živalskega modela za študije učenja 6. Kline in Small sta v svojih vedenjskih testih navadno uporabljala lačne podgane, pomanjkanje hrane pa je postalo zelo razširjen protokol v kasnejših študijah. Lakota je bila prepoznana in uporabljena kot temeljni motivator vedenjske nevroznanosti 7.

Vedenjski testi na živalih v splošnem sestojijo iz treh ključnih elementov: *motivacijski faktor, ki žival motivira za sodelovanje v testu, *opaženo vedenje (vedenje, ki ga pričakujemo, da ga bo žival izkazovala kot odgovor na test) *izmerljiv rezultat (kvantificirana spremenljivka, povezana z vedenjskim odgovorom).

Večina testov do 50. let 20. stoletja je nato uporabljala sistem nagrade ali kazni, kot so pomanjkanje hrane ali električni šoki 8. Vendar pa je aktivno izogibanje povzročanju nelagodja, bolečine ali stresa pri živalih v biomedicinskih raziskavah s časom vodilo k razvoju testov, prijaznih živalim, da se zagotovi dobro počutje živali in izboljša ponovljivost rezultatov. Kot odgovor na te etične in metodološke pomisleke je bilo razvitih več živalim prijaznih vedenjskih testov, ki predstavljajo moderno dobo vedenjske nevroznanosti.

Etološki pristop pri oblikovanju vedenjskih testov

Idealno bi bilo, da vedenjski test ne vsebuje motivacijskega faktorja, ki bi povzročal bolečino ali stres. Opazovano vedenje mora biti naravno. Tako so vedenjski testi, ki so prijazni živalim, primerni za preskušanje motornih ali posturalnih vzorcev, specifičnih za vrsto 8. Merjena spremenljivka, povezana z vedenjem živali, mora biti enostavna za merjenje v laboratoriju z metodo, ki je za žival varna, bodisi z direktnim opazovanjem, snemanjem vedenja, snemanjem zvoka ali ultrasoničnih vokalizacij ter uporabe različnih tipov senzorjev za spremljanje telesne teže, temperature in drugih parametrov.

Večina biomedicinskih raziskav za študije bolezni centralnega živčnega sistema uporablja laboratorijske glodavce, kot so miši in podgane. Kot averzivne dražljaje raziskovalci najpogosteje uporabljajo električne šoke, kar lahko povzroči nezaželene spremembe v možganih. Električni šoki namreč lahko spremenijo nevronsko aktivnost in molekularne mehanizme 8. Prav tako se težava pojavi v študijah, kjer kot nagradni stimulus uporabljajo hrano. Vrsta hrane je navadno izbrana na podlagi dosedanjih standardnih izborov ali po presoji raziskovalca, pri čemer prepogosto ni upoštevana naravna potreba laboratorijskih glodalcev glede tipa hrane, količine, teksture in velikosti. Živali imajo vrstno specifične preference glede hrane in odziva nanjo, zato je upoštevanje preferenc laboratorijskih živali pomembno pri dizajniranju študije 8 9.

Etološki pristop lahko raziskovalcem pomaga pri oblikovanju vedenjskih testov, prijaznih živalim, tako da izberejo vedenja, ki ne zahtevajo bolečih ali stresnih motivacijskih dejavnikov in tudi primerne vrste. Na primer, hrčki, s svojo visoko nagnjenostjo h kopičenju hrane, so primerni kot živalski modeli za nagradne spominske teste brez predhodnega lakote 8.

V zadnjih dveh desetletjih pridobivajo vse večjo pozornost raziskovalcev avtomatizirani sistemi za testiranje v domači kletki, kot so IntelliCage, PhenoMaster, Actual-HCA in SmartKage, 10 11 12 13. Ti sistemi omogočajo podrobna motorična in kognitivna testiranja, pa tudi spremljanje in analizo zapletenih družbenih interakcij. Najnovejša novost je tudi povezovanje hišnih kletk z labirinti, kar eksperimentalnim subjektom omogoča prosto raziskovanje novega testnega okolja. O prednostih in slabostih avtomatiziranih sistemov spremljanja laboratorijskih miši in podgan v domači kletki si lahko preberete več v materialih projekta COST TEATIME 14, v katerem sodelujejo tudi slovenski raziskovalci.

Izboljšana ponovljivost rezultatov

Zmanjšanje stresa pri živalih je ključnega pomena za metodološko zdrave raziskave, saj stres povečuje variabilnost poskusnih rezultatov 15. Na stresno reaktivnost pri živalih vplivajo genetski, epigenetski in okoljski dejavniki 16. Da bi povečali ponovljivost eksperimenta, je bistveno zmanjšanje stresa, povezanega z ravnanjem. Ne-averzivne tehnike ročnega rokovanja in avtomatizirani sistemi za preskušanje v domači kletki lahko pomagajo preprečiti negativne vplive na živali v raziskavi 17 18 19. Neznane lastnosti, specifične za vrsto, neprimerni motivatorji in umetni pogoji lahko povečajo naključno napako pri vedenjskih raziskavah, kar ima za posledico neponovljive rezultate in tudi večje individualne razlike med živalmi.

Etično zasnovana nevroznanost tako združuje znanje za razvoj živalskih modelov in vedenjskih testov, pri čemer se spodbuja živalim prijazno vedenjsko testiranje in skrbi za dobro počutje živali za zagotavljanje zanesljivejših rezultatov.

    ___
  1. Mills, T. W. (1895). The psychic development of young animals and its physical correlation: V – the rabbit and the cavy or guinea pig. Proceed. Trans. Royal Soc. Canada (2nd Series) 1, 231–239. 

  2. Kline, L. W. (1899a). Methods in animal psychology. Am. J. Psychol. 10, 256–279. doi: 10.2307/1412481 

  3. Small, W. S. (1899). Notes on the psychic development of the young white rat. Am. J. Psych. 11, 80–100. doi: 10.2307/1412730 

  4. Mills, T. W. (1888). Squirrels: their habits and intelligence, with special reference to feigning. Proceed. Trans. Royal Soc. Canada (1st Series) 5, 175–188. 

  5. Stewart, C. C. (1898). Variations in daily activity produced by alcohol and by changes in barometric pressure and diet, with a description of recording methods. Am. J. Physiol. 1, 40–56. doi: 10.1152/ajplegacy.1898.1.1.40 

  6. Kline, L. W. (1899a). Methods in animal psychology. Am. J. Psychol. 10, 256–279. doi: 10.2307/1412481 

  7. Small, W. S. (1900). An experimental study of the mental processes of the rat. Am. J. Psych. 11, 133–165. doi: 10.2307/1412267 

  8. d’Isa R and Gerlai R (2023) Designing animal-friendly behavioral tests for neuroscience research: The importance of an ethological approach. Front. Behav. Neurosci. 16:1090248. doi: 10.3389/fnbeh.2022.1090248 

  9. Gerlai, R., and Clayton, N. S. (1999a). Analysing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47–51. doi: 10.1016/S0166-2236(98)01346-0 

  10. Iman, I. N., Yusof, N. A. M., Talib, U. N., Ahmad, N. A. Z., Norazit, A., Kumar, J., et al. (2021). The intellicage system: a review of its utility as a novel behavioral platform for a rodent model of substance use disorder. Front. Behav. Neurosci. 15, 683780. doi: 10.3389/fnbeh.2021.683780 

  11. König, C., Plank, A. C., Kapp, A., Timotius, I. K., von Hörsten, S., and Zimmermann, K. (2020). Thirty mouse strain survey of voluntary physical activity and energy expenditure: influence of strain, sex and day-night variation. Front. Neurosci. 14, 531. doi: 10.3389/fnins.2020.00531 

  12. Mitchell, E. J., Brett, R. R., Armstrong, J. D., Sillito, R. R., and Pratt, J. A. (2020). Temporal dissociation of phencyclidine: induced locomotor and social alterations in rats using an automated homecage monitoring system - implications for the 3Rs and preclinical drug discovery. J. Psychopharmacol. 34, 709–715. doi: 10.1177/0269881120920455 

  13. Ho, H., Kejzar, N., Sasaguri, H., Saito, T., Saido, T. C., De Strooper, B., et al. (2022). A novel fully-automated system for lifelong continuous phenotyping of mouse cognition and behaviour. bioRxiv [preprint]. doi: 10.1101/2022.06.18.496688 

  14. Improving biomedical research by automated behaviour monitoring in the animal home-cage. COST TEATIME. COST Action CA20135. Home | COST Teatime (cost-teatime.org) 

  15. Moreira, P. S., Almeida, P. R., Leite-Almeida, H., Sousa, N., and Costa, P. (2016). Impact of chronic stress protocols in learning and memory in rodents: systematic review and meta-analysis. PLoS ONE 11, e0163245. doi: 10.1371/journal.pone.0163245 

  16. Holmes, A., le Guisquet, A. M., Vogel, E., Millstein, R. A., Leman, S., and Belzung, C. (2005). Early life genetic, epigenetic and environmental factors shaping emotionality in rodents. Neurosci. Biobehav. Rev. 29, 1335–1346. doi: 10.1016/j.neubiorev.2005.04.012 

  17. Gouveia, K., and Hurst, J. L. (2017). Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: The major role of non-aversive handling. Sci. Rep. 7, 44999. doi: 10.1038/srep44999 

  18. Kohler, J., Mei, J., Banneke, S., Winter, Y., Endres, M., and Emmrich, J. V. (2022). Assessing spatial learning and memory in mice: classic radial maze versus a new animal-friendly automated radial maze allowing free access and not requiring food deprivation. Front. Behav. Neurosci. 16, 1013624. doi: 10.3389/fnbeh.2022.1013624 

  19. Ho, H., Kejzar, N., Sasaguri, H., Saito, T., Saido, T. C., De Strooper, B., et al. (2022). A novel fully-automated system for lifelong continuous phenotyping of mouse cognition and behaviour. bioRxiv [preprint]. doi: 10.1101/2022.06.18.496688 

asist. dr. Maša Čater, univ. dipl. bioteh.
Katedra za genetiko, animalno biotehnologijo in imunologijo
Oddelek za zootehniko
Biotehniška fakulteta
Univerza v Ljubljani