SiNAPSA, sreda, 13. december 2017

eSiNAPSA

Spletna revija za znanstvenike, strokovnjake
in nevroznanstvene navdušence

Optogenetika - Metoda leta 2010 po oceni revije Nature Methods

Mara Bresjanac

Znanstveni napredek je odvisen od razvoja novih metod. Zgodovina nevroznanosti beleži skokovite preboje v zadnjih desetletjih prav v povezavi z novimi metodološkimi pristopi (glej prispevek “Možgani Skozi Zgodovino” v tej številki eSinapse). Eden najnovejših je optogenetika, kombinacija optičnih in genetskih metod z namenom časovno in prostorsko natančnega krmiljenja živih celic. Čeprav optogenetika doživlja bliskovit razvoj in uporabo v mnogih fizioloških kontekstih, je doslej prispevala največ prav v raziskavah živčevja.

Mara Bresjanac V razumevanju delovanja nevronskih povezav v sesalskih možganih nas omejuje izjemna zapletenost mrežja, v katerem milijarde živčnih celic komunicirajo med seboj. Da bi razumeli notranjo urejenost tega sistema, bi morali razumeti kako so posamezne populacije nevronov strukturno in funkcijsko povezane med seboj. Doslej prevladujoče metode raziskovanja so razmeroma grobe in neselektivne, kar omejuje razločevanje med posameznimi dogodki in prepoznavo vzročnih mehanizmov v delovanju živčevja. Farmakološke pristope omejuje predvsem izrazita neselektivnost in relativna počasnost učinkov, draženje nevralnih struktur z elektrodami pa kljub hitrosti in navidezni natančnosti poleg želenih tarč neizbežno vpliva tudi na okoliške celice (nevrone in glijo) in sproži tudi spremembe v njihovem delovanju, ki ostanejo nenadzorovane in največkrat nezaznane, a lahko pomembno prispevajo h končnim izidom električnega draženja.

Leta 1979 je Nobelov nagrajenec Francis Crick izpostavil, da je največji izziv za nevroznanost ta, da bi lahko odmerjeno upravljali z delovanjem posameznih vrst nevronov v njihovem naravnem okolju. Sam je v ta namen razmišljal o uporabi svetlobe, toda v tistem času ni bilo na pomolu nobene strategije, ki bi nevrone naredila odzivne na fotone določene valovne dolžine. In vendar so že v začetku 70-ih mikrobiologi poznali organizme, ki proizvajajo svetlobno-občutljive membranske proteine, kanalčke, ki uravnavao pretok ionov skozi membrano. Bakteriorodopsinska ionska črpalka, ki se hitro odziva na fotone vidne svetlobe je bila odkrita 1971. leta, njej pa so v nadaljnih desetletjih sledile še druge predstavnice iste družine molekul 1.

Slika 1: Svetloba vzdraži nevrone petega sloja podganje primarne motorične skorje, ki izražajo svetlobno-občutljiv opsinski ionski kanalček, kar vpliva na nevrone subtalamičnega jedra in izzove izboljšanje motorične funkcije: parkinsonska podgana med testom spontanega gibanja ob stimulaciji z lučjo opravi veliko daljšo in razgibano pot (bela sled v soju modre luči na desni strani slike) v primerjavi s kontrolnimi pogoji, ko je luč ugasnjena (bela sled na levi). Prirejeno po izvirni sliki dr. Viviane Gradinaru, z dovoljenjem avtorice.

Raznorodna svetova mikrobnih svetlobno-občutljivih membranskih ionskih črpalk in nevralnih vezij, kjer so za vzdražne lastnosti sistema in bliskovito hiter prenos informacij odgovorni prav membranski ionski kanalčki, se nista staknila vse do 21. stoletja, ko so prvič opisali, da vnos mikrobnega gena za rodopsin naredi nevrone ponovljivo in odmerjeno odzivne na svetlobo 2. Odtlej je več raziskav potrdilo uspešen vnos in izražanje genov za različne svetlobno-občutljive ionske kanalčke v nevronih. Ker se ti geni izražajo pod regulatornim vplivom določenih - za posamezne nevrone specifičnih - odsekov DNA, to omogoči, da izbrane populacije nevronov (in zgolj te) “prižgemo” ali “ugasnemo” v njihovem naravnem okolju le z osvetlitvijo s svetlobo ustrezne valovne dolžine (t.j. barve). Srečna okoliščina, ki omogoča tako uspešen prenos mikrobnih ionskih črpalk v sesalske nevrone je naravno visoka vsebnost trans-retinala, nepogrešljivega kofaktorja za mikrobne opsine, v tkivih vretenčarjev 1.

Te prve študije so botrovale nedavni eksploziji objav, ki kažejo, da so z novo tehnologijo postali raziskovalno dostopni tudi nekateri donedavna najtrši orehi nevroznanosti. Za ilustracijo omenimo le primer zanimive optogenetske dekonstrukcije nevralnih povezav pri parkinsonskih glodalcih 3.

V seriji zanimivih poskusov so Gradinaru in sodelavci iskali odgovor na vprašanje, kaj je mehanizem terapevtskega učinka električnega draženja subtalamičnega jedra (STJ), postopka, ki je v klinični rabi za lajšanje znakov Parkinsonove bolezni (in katerega uporaba se širi tudi v področje psihiatrije - glej prispevek o draženju globokih možganskih struktur (DGMS)). S sistematično uporabo optogenetskega pristopa za aktivacijo oziroma inhibicijo komponent nevralnih povezav STJ pri prosto gibajočih se glodalcih s kemično povzročenim parkinsonizmom so raziskovalci pokazali, da pozitivnih učinkov električnega draženja tega jedra ni mogoče pripisati neposredni električni inhibiciji nevronov STJ. To je bilo nekoliko presenetljivo, saj je inhibicija nevronov STJ temelj prevladujoče razlage o učinku DGMS, ki naj bi povzročala reverzibilno “informacijsko lezijo”. Prav tako ni bilo mogoče reproducirati izboljšav v motoriki, kakršne sproži DGMS, prek neposredne optogenetske aktivacije nevronov STJ. Pri svoji raziskavi se Gradinaru in sodelavci niso omejili le na same živčne celice, temveč so s ciljanim optogenetskim pristopom preverili tudi, ali so učinki DGMS na parkisnonske znake lahko posledica aktivacije astrocitov in njihovih modulatornih učinkov na nevrone STJ. Kljub učinkoviti aktivaciji astrocitov in potrditvi njihovega zaviralnega učinka na proženje nevronov STJ, se ob njihovi neposredni optogenetski aktivaciji motorični primanjkljaj ni zmanjšal. Pač pa se je motorika parkinsonskih glodalcev izboljšala ob porastu visokofrekventnih prilivov po aferentnih vlaknih, ki oživčujejo STJ. To jedro prejema aferentne prilive iz mnogih področij možganov in Gradinaru je s sodelavci opravila obsežno sistematično detektivsko delo ter na koncu vpliv pripisala nevronom v globini primarne motorične skorje. Selektivno visoko frekventno draženje nevronov petega sloja tega predela možganov je imelo neposreden učinek na aktivnost nevronov STJ in izboljšalo vse motorične primanjkljaje parkinsonskih glodalcev 3. Čeprav so avtorji previdni v svojem sklepanju in ne ekstrapolirajo zaključkov iz kemijskega parkinsonizma glodalcev na večinoma idiopatsko Parkinsonovo bolezen pri ljudeh, njihove ugotovitve predstavljajo pomemben vir informacij za nadaljne raziskave ne le patofiziologije in zdravljenja Parkinsonove bolezni, temveč tudi terapevtskih prijemališč in vzvodov DGMS.

    ___
  1. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Method 2011; 8:26-9. 

  2. Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G, Deisseroth K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci 2008; 8: 1263-8. 

  3. Gradinaru V, Mogri M, Thompson KR, Henderson JM, Deisseroth K. Optical Deconstruction of Parkinsonian Neural Circuitry. Science 2009; 324: 354-9. DOI: 10.1126/science.1167093 

prof. dr. Mara Bresjanac (maja.bresjanac@lnpr.mf.uni-lj.si)
Laboratorij za regeneracijo in plastičnost živčevja
Inštitut za patološko fiziologijo, Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani