SiNAPSA, sreda, 30. september 2026

eSiNAPSA

Spletna revija za znanstvenike, strokovnjake
in nevroznanstvene navdušence

Naslovnica Članki Intervjuji Mnenja Zdravje Korenine eSinapsa Številke RSS

Primer iz prakse: predklinični razvoj novih učinkovin za zdravljenje bolezni možganov

Urban Košak

Uvod

Vsako zdravilo je sestavljeno iz ene ali več učinkovin (angl. drug ali active pharmaceutical ingredient, API) in pomožnih snovi (angl. excipients). Učinkovina je snov, ki z ustreznim delovanjem na tarčo (npr. z zaviranjem encima), vključeno v bolezensko stanje, to stanje izboljša. Po kemijski zgradbi so učinkovine lahko anorganske snovi (npr. litijev karbonat), male organske molekule (npr. paracetamol) ali makromolekule (npr. inzulin). Med makromolekule sodijo tudi monoklonska protitelesa 1 [npr. lekanemab za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni (AB)].

Tarča učinkovine je biološka struktura v telesu ali povzročitelju okužbe (npr. bakteriji); najpogosteje so to encimi, receptorji, ionski kanali, transportni proteini, DNK, RNK in ribosomi. Manj pogoste tarče so substrati, metaboliti, rastni dejavniki in različni fizikalno-kemijski procesi, tarče nekaterih učinkovin pa (še) niso znane.1 Pomožna snov je vsaka sestavina zdravila, ki ni učinkovina, oziroma snov, uporabljena pri njegovi izdelavi. Zagotavlja ustrezne fizikalno-kemijske lastnosti zdravila, podpira delovanje učinkovine in/ali prispeva k njenemu boljšemu prenašanju. Pomožne snovi so lahko anorganske (npr. cinkov oksid) ali organske snovi (npr. laktoza). 2

Vsaka učinkovina mora izpolnjevati štiri ključne pogoje:
1. Doseganje mesta delovanja v zadostni koncentraciji: po vnosu v telo mora priti v tkivo, v katerem poteka bolezenski proces.
2. Specifično delovanje na tarčo: v tkivu ustrezno deluje na biološko tarčo.
3. Učinkovitost: z delovanjem na tarčo ugodno vpliva na bolezensko stanje.
4. Varnost: v terapevtskih odmerkih ne povzroča nesprejemljivih neželenih učinkov.

Proces odkrivanja in razvoja nove učinkovine lahko razdelimo na predklinično fazo, klinično fazo, regulatorno presojo in odobritev pristojnih organov [npr. ameriške Uprave za hrano in zdravila (angl. Food and Drug Administration, FDA) ali Evropske agencije za zdravila (angl. European Medicines Agency, EMA)] ter na fazo oziroma obdobje po vstopu učinkovine na trg (Slika 1). 3 4 5

Slika 1
Slika 1: Proces odkrivanja in razvoja novih učinkovin. Slika je bila narejena s pomočjo programa ChemDraw Professional 23 (Revvity Signals Software, LLC, Waltham, Massachusetts, ZDA).


Identifikacija bolezni in tarče

V okviru predkliničnega razvoja novih učinkovin smo za tarčno bolezen izbrali AB, za biološko tarčo pa butirilholinesterazo (BChE). Ta encim velja za potrjeno tarčo6 za zdravljenje te bolezni, saj je dokazano udeležen v njeni patogenezi; z zaviranjem BChE v možganih namreč lahko ublažimo bolezenske simptome. Rivastigmin je odobrena učinkovina za zdravljenje AB, ki z zaviranjem BChE in acetilholinesteraze (AChE) zviša raven acetilholina (ACh) v možganih.7 Ker pa je prav zaviranje AChE povezano s številnimi neželenimi učinki,8 je bil naš cilj razviti zaviralce BChE, ki ne zavirajo AChE.

Odkritje spojine zadetka

Spojina zadetek (angl. hit compound) je biološko aktivna spojina, katere aktivnost v določenem testu presega vnaprej določen prag. 3 4 Našo spojino zadetek smo odkrili s hierarhičnim protokolom virtualnega rešetanja, ki mu je sledilo biokemijsko ovrednotenje 40 najobetavnejših spojin. Najprej smo iz podzbirke zbirke ZINC z 11,3 milijona spojin, podobnih zdravilnim učinkovinam, 9 10s programsko opremo OBGREP – orodjem za delo v ukazni vrstici, vključenim v brezplačni odprtokodni program Open Babel (2.2.3) 11 – izluščili vse amine (spojine z aminsko skupino). Teh je bilo 4,037 milijona.

Nato smo s programsko opremo FILTER 2.0.2 (OpenEye Scientific Software, Inc., Santa Fe, NM, USA; www.eyesopen.com) odstranili spojine s predvideno slabo vodotopnostjo in spojine, nagnjene k tvorbi agregatov, 12 s čimer smo nabor zožili na 1,495 milijona spojin. V zadnjem koraku smo spojine obdelali s programom Omega 2.4.3 (OpenEye Scientific Software, Inc., Santa Fe, NM, ZDA; www.eyesopen.com) 13 14 z uporabo privzetih nastavitev in s tem pripravili različne konformacije, ki so pokrivale čim večji del konformacijskega prostora. Za molekulsko sidranje smo tako uporabili knjižnico z 1,495 milijona spojin s povprečno 158 konformacijami na spojino.

Aktivno mesto človeške BChE (hBChE) smo pripravili s programoma PyMOL 1.7 (Schrödinger, LLC, New York, NY, ZDA) in FRED RECEPTOR 2.2.5 (OpenEye Scientific Software, Inc., Santa Fe, NM, ZDA; www.eyesopen.com). V pripravljeno vezavno mesto smo s programom FRED 2.2.5 in točkovalno funkcijo Chemgauss3 (OpenEye Scientific Software, Inc., Santa Fe, NM, ZDA; www.eyesopen.com) sidrali 15 16 17 našo knjižnico spojin. Štirideset najvišje uvrščenih spojin smo nato naročili pri različnih dobaviteljih in določili njihovo jakost zaviranja hBChE in mišje AChE (mAChE) in vitro. Med njimi je hBChE najmočneje (IC50 = 21 nM) in najbolj selektivno [IC50(mAChE)/IC50(hBChE) = 4790] zaviral N-indenpiperidinamidni derivat (Slika 2). Ta spojina pri koncentraciji 10 µM ni izkazovala citotoksičnosti na človeški celični liniji nevroblastoma SH-SY5Y. Zaradi teh lastnosti smo jo opredelili kot spojino zadetek18 in je predstavljala izhodišče za razvoj spojine vodnice (Slika 3).

Slika 1
Slika 2. Odkritje spojine zadetek. Slika je bila narejena v programu ChemDraw Professional 23 (Revvity Signals Software, LLC, Waltham, Massachusetts, ZDA).


Razvoj spojine vodnice

Spojina vodnica (angl. lead compound) je spojina, ki izkazuje želeno aktivnost in selektivnost v farmakološko ali biokemijsko relevantnem presejalnem testu.3,4 Na podlagi strukture spojine zadetka smo načrtovali in sintetizirali 41 njenih derivatov ter jim in vitro določili jakost zaviranja hBChE in mAChE. Med njimi je hBChE najmočneje (IC50 = 4,9 nM) in najbolj selektivno [IC50(mAChE)/IC50(hBChE) > 20408] zaviral N-benzilpiperidinsulfonamidni derivat (Slika 3).

Podobno kot spojina zadetek tudi ta derivat pri koncentraciji 10 µM ni izkazoval citotoksičnosti na človeški celični liniji nevroblastoma SH-SY5Y. Dokazali smo, da spojina vodnica po intraperitonealni aplikaciji pri podganah prehaja v možgane ter izboljša spomin in učne sposobnosti pri miših z induciranimi simptomi, podobnimi AB. 19 Poleg tega izboljša kognitivne funkcije pri psih s kognitivno motnjo. 20 Pri podganah linije Flinders Sensitive Line (FSL), ki predstavljajo genetski model velike depresivne motnje, spojina izboljša kognitivne funkcije ter ublaži depresiji podobno vedenje in anhedonijo (nezmožnost doživljanja ugodja). 21 Ob tem pri miših, psih in podganah ne povzroča neželenih holinergičnih učinkov, 19 20 21 značilnih za odobrene učinkovine, ki zvišujejo koncentracijo ACh v možganih (npr. rivastigmin). 7

Slika 1
Slika 3. Razvoj spojine vodnice iz spojine zadetek. Slika je bila narejena s pomočjo programa ChemDraw Professional 23 (Revvity Signals Software, LLC, Waltham, Massachusetts, ZDA).


Optimizacija spojine vodnice

Čeprav spojina vodnica močno zavira hBChE in izkazuje želene učinke in vivo (Slika 3), je racemat (zmes dveh enantiomerov) in po intraperitonealni aplikaciji pri podganah skromno prehaja v možgane (razmerje med koncentracijo v možganih in plazmi znaša 0,44). Zato smo želeli razviti čisti enantiomer ali akiralno spojino z vsaj primerljivim farmakološkim učinkom in boljšim prehajanjem v možgane – optimizirano spojino vodnico (angl. optimized lead compound).

Ker je prehajanje spojin v možgane mogoče izboljšati z zmanjšanjem molekulske mase (MM), števila vrtljivih vezi (ŠVV) in topološke polarne površine (TPP) 22, smo načrtovali derivate spojine vodnice z ugodnejšimi vrednostmi teh parametrov. Sintetizirali smo 23 derivatov in vsem in vitro določili jakost zaviranja hBChE in človeške AChE (hAChE). Najobetavnejša spojina je imela v primerjavi z izhodiščno spojino vodnico za 58 g/mol manjšo MM, tri vrtljive vezi manj in za 9 Å2 manjšo TPP.

Poleg tega je ta spojina čisti enantiomer, ki močneje zavira hBChE [Ki = 6,6 nM; Ki (spojina vodnica) = 10,2 nM] in je na človeški celični liniji nevroblastoma SH-SY5Y manj citotoksična (z višjo vrednostjo LD50). V primerjavi s spojino vodnico po peroralni aplikaciji kar sedemkrat bolje prehaja v možgane miši ter izboljša spomin in učne sposobnosti pri miših s simptomi, podobnimi AB, induciranimi bodisi s skopolaminom bodisi z amiloidom beta (Aβ1-42) (Slika 4). Nasprotno spojina vodnica pri enakem odmerku ne izboljša spomina in učnih sposobnosti pri miših s kognitivnimi motnjami, povzročenimi z Aβ1-42. Optimizirana spojina vodnica ni akutno toksična ter pri miših ne povzroča holinergičnih neželenih učinkov ali motoričnih motenj.23

Slika 1
Slika 4. Optimizacija spojine vodnice. Slika je bila narejena s pomočjo programa ChemDraw Professional 23 (Revvity Signals Software, LLC, Waltham, Massachusetts, ZDA).


Zaključek

Predklinični razvoj novih učinkovin za zdravljenje AB smo začeli z izbiro BChE kot biološke tarče in s ciljem načrtovati njene zaviralce, ki ne zavirajo AChE. S hierarhičnim protokolom virtualnega rešetanja, ki mu je sledilo biokemijsko ovrednotenje, smo odkrili spojino zadetek, katere struktura je služila kot izhodišče za razvoj spojine vodnice. Čeprav je ta kazala želene učinke in vivo, je po intraperitonealni aplikaciji pri podganah le v omejenem obsegu prehajala v možgane.

Z nadaljnjim načrtovanjem smo razvili optimizirano spojino vodnico, ki po peroralni administraciji kar sedemkrat bolje prehaja v možgane miši ter ohranja želeno učinkovitost in vivo. Terapevtsko uporabo spojine vodnice za zdravljenje AB, pasje kognitivne motnje in depresije ter uporabo optimizirane spojine vodnice za zdravljenje nevroloških bolezni in motenj smo zaščitili s patentnimi prijavami (oz. s pravicami intelektualne lastnine).

    ___

  1. Imming P, Sinning C, Meyer A. Drugs, their targets and the nature and the nature of drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 2006 Oct 1; 5: 821–834. https://doi.org/10.1038/nrd2132 ↩

  2. Obreza A, Bevc B, Baumgartner S, Sollner Dolenc M, Humar M. Pomožne snovi v farmaciji: od njihovega poimenovanja do vloge v zdravilu: Spletni učbenik za študente farmacije, industrijske farmacije in kozmetologije. El. knjiga. - Ljubljana : Fakulteta za farmacijo, 2015. https://www.ffa.uni-lj.si/fileadmin/datoteke/Knjiznica/e-knjige/Pomozne_snovi.pdf ↩

  3. Bleicher KH, Böhm HJ, Müller K, Alanine AI. Hit and lead generation: beyond high-throughput screening. Nature Reviews Drug Discovery. 2003 May 1; 2: 369–378. https://doi.org/10.1038/nrd1086 ↩

  4. Lombardino JG, Lowe JA. The role of the medicinal chemist in drug development – then and now. Nature Reviews Drug Discovery. 2004 Oct; 3: 853–862. https://doi.org/10.1038/nrd1523 ↩

  5. Kaitin KI. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2010 Feb 3; 87 (3): 356–361. https://doi.org/10.1038/clpt.2009.293 ↩

  6. Bar-On P, Millard CB, Harel M, Dvir H, Enz A, Sussman JL, Silman I. Kinetic and structural studies on the interaction of cholinesterases with the anti-Alzheimer drug rivastigmine. Biochemistry. 2002 Feb 19; 41 (11): 3555−3564. https://doi.org/10.1021/bi020016x ↩

  7. Irwin JJ, Sterling T, Mysinger MM, Bolstad ES, Coleman RG. ZINC: A free tool to discover chemistry for biology. Journal of Chemical Information and Modeling. 2012, May 15; 52 (7): 1757–1768. https://doi.org/10.1021/ci3001277 ↩

  8. Lipinski CA. Drug-like properties and the causes of poor solubility and poor permeability. 2000 Jul–Aug; 44 (1): 235–249. https://doi.org/10.1016/S1056-8719(00)00107-6 ↩

  9. O’Boyle NM, Banck M, James CA, Morley C, Vandermeersch T, Hutchison GR. Open Babel: An open chemical toolbox. Journal of Cheminformatics. 2011 Oct 7;3: 33. https://doi.org/10.1186/1758-2946-3-33 ↩

  10. Shoichet BK. Interpreting steep dose-response curves in early inhibitor discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 2006 Nov 10; 49 (25): 7274–7277. https://doi.org/10.1021/jm061103g ↩

  11. Hawkins PCD, Nicholls A. Conformer generation with OMEGA: Learning from the data set and the analysis of failures. Journal of Chemical Information and Modeling. 2012 Oct 19; 52 (11): 2919–2936. https://doi.org/10.1021/ci300314k ↩

  12. Hawkins PCD, Skillman AG, Warren GL, Ellingson BA, Stahl MT. Conformer generation with OMEGA: Algorithm and validation using high quality structures from the protein databank and Cambridge structural database. Journal of Chemical Information and Modeling. 2010, Mar 17; 50 (4): 572–584. https://doi.org/10.1021/ci100031x ↩

  13. McGann M. FRED pose prediction and virtual screening accuracy. Journal of Chemical Information and Modeling. 2011 Feb 16; 51 (3): 578–596. https://doi.org/10.1021/ci100436p ↩

  14. McGaughey GB, Sheridan RP, Bayly CI, Culberson JC, Kreatsoulas C, Lindsley S, Maiorov V, Truchon JF, Cornell WD. Comparison of topological, shape, and docking methods in virtual screening. Journal of Chemical Information and Modeling. 2007 Jun 26; 47 (4): 1504–1519. https://doi.org/10.1021/ci700052x ↩

  15. McGann MR, Almond HR, Nicholls A, Grant JA, Brown FK. Gaussian docking functions. Biopolymers. 2003 Dec 2 2002; 68: 76–90. https://doi.org/10.1002/bip.10207 ↩

  16. Košak U, Brus B, Knez D, Šink R, Žakelj S, Trontelj J, Pišlar A, Šlenc J, Gobec M, Živin M, Tratnjek L, Perše M, Sałat K, Podkowa A, Filipek B, Nachon F, Brazzolotto X, Więckowska A, Malawska B, Stojan J, Mlinarič Rasčan I, Kos J, Coquelle N, Colletier JP, Gobec S. Development of an in-vivo active reversible butyrylcholinesterase inhibitor. Scientific Reports. 2016 Dec 21; 6: 39495. https://doi.org/10.1038/srep39495 ↩

  17. Zakošek Pipan M, Prpar Mihevc S, Štrbenc M, Košak U, German Ilić I, Trontelj J, Žakelj S, Gobec S, Pavlin D, Gregor Majdič G. Treatment of canine cognitive dysfunction with novel butyrylcholinesterase inhibitor. Scientific Reports. 2021 Sep 13; 11: 18098. https://doi.org/10.1038/s41598-021-97404-2 ↩

  18. Olivier N, Harvey BH, Gobec S, Shahid M, Košak U, Žakelj S, Brink CB. A novel butyrylcholinesterase inhibitor induces antidepressant, pro-cognitive, and anti-anhedonic effects in Flinders Sensitive Line rats: The role of the ghrelin-dopamine cascade. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2025 May 2; 187: 118093. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2025.118093 ↩

  19. Rankovic Z. CNS drug design: Balancing physicochemical properties for pptimal Brain exposure. Journal of Medicinal Chemistry. 2015 Mar 26; 58 (6): 2584–2608. https://doi.org/10.1021/jm501535r ↩

  20. Košak U, Strašek Benedik N, Knez D, Žakelj S, Trontelj J, Pišlar A, Horvat S, Bolje A, Žnidaršič N, Grgurevič N, Švara T, Kljun J, Skrzypczak-Wiercioch A, Lv B, Xiong Y, Wang Q, Bian R, Shao J, Dias J, Nachon F, Brazzolotto X, Stojan J, Sun H, Sałat K, Gobec S. Lead optimization of a butyrylcholinesterase inhibitor for the treatment of Alzheimer’s disease. Journal of Medicinal Chemistry. 2025 June 2; 68 (11): 11693–11723. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c00577 ↩

doc. dr. Urban Košak, mag. farm.
Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani